本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了甘薯種薯及種苗的繁育規(guī)程，適用于河南省各甘薯種薯（苗）產(chǎn)地及栽培區(qū)。

2脫毒種薯（苗）的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2.1 高級(jí)脫毒試管苗

即經(jīng)過(guò)嚴(yán)格病毒檢測(cè)確認(rèn)不含有已知病毒或指定病毒，且經(jīng)過(guò)株系評(píng)選而中選的優(yōu)良試管苗以及用它離體快繁或防蚜蟲(chóng)條件下速繁后得到的甘薯試管苗。

2.2原原種

即在防蚜蟲(chóng)網(wǎng)棚內(nèi)無(wú)病原土壤上栽種高級(jí)脫毒試管苗生產(chǎn)的種薯。用原原種種薯在防蚜蟲(chóng)條件下育出的薯苗叫原原種苗。

2.3原種

即利用原原種苗在具備500m以上隔離條件（即500m 內(nèi)沒(méi)有種植普通帶毒甘薯）而且土壤無(wú)病原的田塊生產(chǎn)的種薯。由原種在防蚜蟲(chóng)條件下育出的薯苗叫原種苗。

2.4良種

即利用原種苗在普通無(wú)病留種田塊生產(chǎn)的種薯。良種育出的苗叫良種苗。

脫毒甘薯種薯分級(jí)指標(biāo)

注：1.病毒檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)甘薯脫毒苗病毒檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)。

2.薯塊分級(jí)（純度、整齊度、不完整薯塊）按GB4406-84標(biāo)準(zhǔn)確定。薯塊整齊度是指重100～250g的薯塊占總量的百分比；不完整薯塊系指機(jī)械損傷、蟲(chóng)鼠咬傷、自然干裂或嚴(yán)重畸形的薯塊所占總塊數(shù)的百分比。

3脫毒甘薯種薯（苗）生產(chǎn)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)

3.1高級(jí)脫毒試管苗生產(chǎn)

3.1.1脫毒莖尖苗培育

選具有本品種特征特性的無(wú)病甘薯苗莖頂部3cm長(zhǎng)的芽段，用70%酒精、3%漂白粉液分別消毒，在超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖鏡下剝離莖尖。將剝離的長(zhǎng)約0.2～0.5mm（一般帶1～2個(gè)葉原基）的莖尖接種在附加1～2mg/l 6-BA的MS培養(yǎng)基上，26～28℃下光培養(yǎng)，莖尖膨大變綠后轉(zhuǎn)入無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)成莖尖試管苗。待苗長(zhǎng)至5～6片葉時(shí)移至營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)進(jìn)行病毒檢測(cè)。

脫毒莖尖苗是指莖尖分生組織培養(yǎng)得到的不含有已知病毒或指定病毒的莖尖苗。必須經(jīng)過(guò)本規(guī)程中有關(guān)方法及程序進(jìn)行病毒檢測(cè)，從中篩選出脫毒莖尖苗。

3.1.2高級(jí)脫毒試管苗繁育

經(jīng)病毒檢測(cè)確認(rèn)的脫毒苗必須進(jìn)行優(yōu)良株系評(píng)選，淘汰變異株系，保留優(yōu)良株系。株系評(píng)選的方法是：將脫毒苗株系切段快繁成10株以上，每系取5～10株栽種到防蟲(chóng)網(wǎng)室內(nèi)，以同品種普通帶毒薯為對(duì)照，進(jìn)行形態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)、產(chǎn)量等多方面的觀察評(píng)定，選出若干既符合品種特性又高產(chǎn)的最優(yōu)株系，混合繁殖成原原種。與最優(yōu)株系相同來(lái)源的脫毒試管苗混合快繁，即為高級(jí)脫毒試管苗。

高級(jí)脫毒試管苗離體切段快繁：將待繁的高級(jí)脫毒試管苗在無(wú)菌條件下切成一葉一節(jié)的切段，扦插在無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上，在26～28℃， 14～16h光照條件下離體培養(yǎng)，25～30d左右即可長(zhǎng)成5～7片葉大小的幼苗，可以進(jìn)入下一輪切段快繁。

3.2原原種繁育

脫毒甘薯原原種的繁育必須具備3方面的條件。第一，栽種的苗必須是高級(jí)脫毒試管苗。第二，必須要在防蟲(chóng)網(wǎng)棚內(nèi)生產(chǎn)原原種。防蟲(chóng)網(wǎng)棚是繁育原原種的重要條件之一，而且所用防蟲(chóng)網(wǎng)的網(wǎng)眼必須在40目以上，這樣蚜蟲(chóng)就不能通過(guò)，可以大大減少蚜蟲(chóng)傳播病毒的機(jī)會(huì)。第三，所用地塊必須是無(wú)病原土壤，最好選用多年未栽種過(guò)甘薯的土壤。

在繁殖原原種時(shí)，要始終貫穿防止病毒再侵染的意識(shí)。在網(wǎng)棚內(nèi)每隔5～10米種植一些指示植物，每隔15天噴灑一次殺蟲(chóng)藥劑，防治蚜蟲(chóng)，以防蚜蟲(chóng)傳毒。防蚜蟲(chóng)時(shí)最好多種藥劑輪換使用，以免蚜蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性，達(dá)不到防治效果。

原原種生產(chǎn)過(guò)程中要定期逐株觀察是否有病毒癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)病株要堅(jiān)決拔除。如果網(wǎng)棚內(nèi)所種植的指示植物表現(xiàn)病毒癥狀，整個(gè)棚內(nèi)所繁殖的種薯應(yīng)降級(jí)使用。

3.3原種繁育

原種的繁殖必須具備（1）所用薯苗為原原種苗；（2）具有500m內(nèi)無(wú)普通帶毒甘薯種植的空間隔離條件；（3）所用田塊至少3年以上沒(méi)種過(guò)普通帶毒甘薯，且為無(wú)莖線蟲(chóng)病、根腐病、黑斑病等的無(wú)病田。

原種繁殖時(shí)要密切注意防止病毒再侵染。要在繁殖田內(nèi)每隔15～20米種植一些指示植物，每15d定期噴灑防蚜蟲(chóng)藥劑，以防蚜蟲(chóng)傳毒。收獲前要觀察病毒發(fā)病情況，及時(shí)拔去病株。收獲時(shí)嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，不符合質(zhì)量要求的薯塊堅(jiān)決不入窖。

3.4良種繁育

良種繁育必須具備條件：（1）必須用原種苗進(jìn)行繁育；（2）所用田塊應(yīng)為無(wú)病留種田，無(wú)莖線蟲(chóng)病、根腐病、黑斑病等。

各級(jí)種薯生產(chǎn)的要求和主要措施

4脫毒苗的病毒檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)

4.1脫毒苗的病毒檢測(cè)方法

4.1.1目測(cè)法

目測(cè)法是根據(jù)甘薯葉片和薯塊上出現(xiàn)的典型癥狀判斷甘薯是否感染病毒。甘薯病毒病的癥狀主要包括：（1）葉斑型。主要有紫色羽狀斑、紫斑、紫環(huán)斑、黃色斑或者枯斑（2）花葉型。苗期感病后，初期葉脈呈網(wǎng)狀透明，后沿葉脈出現(xiàn)不規(guī)則黃綠相間的花葉斑紋（3）卷葉型。葉片邊緣上卷，嚴(yán)重者可形成杯狀（4）葉片皺縮型。病苗葉片較小，皺縮，葉緣不整齊，甚至扭曲畸形（5）葉片黃化型。包括葉片黃化及網(wǎng)狀黃脈。薯塊上的癥狀主要是產(chǎn)生黑褐色或黃褐色龜裂紋。

病毒病的癥狀可因病毒種類(lèi)、甘薯品種以及環(huán)境條件等因素的影響而改變，因此根據(jù)癥狀只能作初步判斷。另外，目測(cè)法還應(yīng)注意區(qū)分甘薯品種特性以及由于土壤水份對(duì)大、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)等原因造成的生理病害與病毒病癥狀的差異。

4.1.2指示植物法

常用巴西牽牛(Ipomoea setosa)作指示植物，幾乎所有侵染甘薯的病毒都能感染巴西牽牛，因此，將薯苗嫁接在巴西牽牛上，從巴西牽牛的顯癥情況可判斷薯苗是否帶毒。具體嫁接方法如下：以薯苗芽尖作接穗，將芽尖削成楔形，另將具3-4片真葉的巴西牽牛作砧木，在其莖中部切一斜口把楔形接穗插入，用封口膜扎住，置防蟲(chóng)網(wǎng)室內(nèi)遮陰保濕3-4天，然后在自然光照下觀察記載牽牛的顯癥情況，一般嫁接后25～30天左右開(kāi)始出現(xiàn)癥狀,顯癥初期新生葉出現(xiàn)系統(tǒng)性明脈，以后發(fā)展為花葉或皺縮等癥狀。

4.1.3甘薯病毒的血清學(xué)檢測(cè)

常用的血清學(xué)檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）或在此基礎(chǔ)上改進(jìn)的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法（Dot-Blot ELISA）等。Dot-Blot ELISA具有快速和能檢測(cè)大量樣品的特點(diǎn)，在大量檢測(cè)樣品時(shí)較常應(yīng)用。具體檢測(cè)方法如下：

(1)樣品處理：取直徑約為1cm的樣品葉片（約0.1g），加入1ml抽提緩沖液，迅速研磨，置小離心管中，取上清液供檢測(cè)用。

(2)點(diǎn)樣：將NC膜在TBS(20mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, )中充分濕潤(rùn)，然后放在一張干燥濾紙上，讓其稍事干燥，用鉛筆作好記號(hào)，用微量取樣器進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)樣后讓NC膜自然干燥。

(3)反應(yīng):

（a）封閉: 將點(diǎn)樣后的NC膜轉(zhuǎn)入封閉液(TBST+5%脫脂奶粉)中封閉1小時(shí)或4℃封閉過(guò)夜。

(b) 第一抗體反應(yīng): 封閉后的NC膜用TBST(20mM Tris-HCl, pH7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20)漂洗2-3次, 每次5-10分鐘, 加入用TBST稀釋的病毒?；寡?span>(1:2000) 37℃保溫1小時(shí), 再用TBST洗膜3次, 每次5-10分鐘。

(c) 第二抗體反應(yīng): 加入TBST稀釋的堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:5000), 37℃保溫1小時(shí), 再用TBST洗膜3次, 每次5-10分鐘。

(d) 顯色: 避光條件下, 將NC膜置于含330μg/ml NBT和165μg/ml BCIP的堿性磷酸酯酶緩沖液(100mM Tris-HCl, pH9.5, 100mM NaCl, 5mM MgCL₂)中顯色至樣點(diǎn)清晰, 將膜放入蒸餾水中漂洗, 終止顯色反應(yīng)。取出晾干, 拍照。

4.1.4分子生物學(xué)方法檢測(cè)

近年來(lái)，隨著分子病毒學(xué)的發(fā)展，一些甘薯病毒（例如SPFMV、SPLV等）的核苷酸序列已經(jīng)清楚，根據(jù)已知的核酸序列，設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR可快速檢測(cè)甘薯病毒和病毒的不同株系。也可利用核酸探針，通過(guò)核酸雜交的方法檢測(cè)病毒的存在。

4.2 不同級(jí)別脫毒苗的檢測(cè)

由于甘薯脫毒苗在繁育過(guò)程中極易受到病毒的再侵染，因此，在繁種過(guò)程中，除根據(jù)不同級(jí)別種薯的繁種要求采取防治蚜蟲(chóng)等必要措施外，還應(yīng)加強(qiáng)病毒的檢測(cè)，及時(shí)淘汰感病種薯以保證脫毒種薯的質(zhì)量。根據(jù)不同級(jí)別種薯對(duì)病毒感染率的要求，可采取不同的病毒檢測(cè)方法。

4.2.1 莖尖苗的檢測(cè)

莖尖苗的檢測(cè)可首先采取目測(cè)法。由于脫毒莖尖苗和帶毒莖尖苗在形態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)上有明顯差異，前者生長(zhǎng)快、葉片平展、植株較健壯；后者長(zhǎng)勢(shì)弱，葉片上常出現(xiàn)花葉、明脈和褪綠斑等癥狀，因此，可先用目測(cè)法淘汰弱苗和顯癥苗。然后再用血清學(xué)方法或分子生物學(xué)方法進(jìn)行篩選，經(jīng)血清學(xué)或分子生物學(xué)方法檢測(cè)呈陰性的樣品再進(jìn)行嫁接。每個(gè)莖尖苗一般嫁接3-5株，有1株發(fā)病即認(rèn)為該樣帶毒，對(duì)于都不發(fā)病的樣品應(yīng)再重復(fù)嫁接1次。

4.2.2 原原種田的檢測(cè)

脫毒原原種的繁殖一般在防蟲(chóng)網(wǎng)室內(nèi)進(jìn)行，原原種田病毒的檢測(cè)方法是：首先在原原種田種植若干株巴西牽牛，定期觀察巴西牽牛是否顯癥、以判斷是否有蚜蟲(chóng)傳毒；對(duì)原原種田還要進(jìn)行定期普查，及時(shí)淘汰顯癥株和變異株；另外對(duì)原原種田要定期取樣，用血清學(xué)方法或嫁接指示植物的方法進(jìn)行檢測(cè)，以判斷原原種田病毒的感染情況，對(duì)于病毒感染率超標(biāo)的繁種田要降級(jí)使用。

4.2.3 原種田的檢測(cè)

脫毒原種的繁殖要在有一定隔離區(qū)的地方進(jìn)行，即周?chē)?span>500米內(nèi)不能種植非脫毒薯。原種田的病毒檢測(cè)以目測(cè)法和田間種植巴西牽牛為主，必要時(shí)田間取樣用血清學(xué)方法檢測(cè)病毒的感染率。

4.2.4 良種田的檢測(cè)

良種田的病毒檢測(cè)以目測(cè)法為主，就是要定期對(duì)良種田的發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查，必要時(shí)也可抽樣用血清學(xué)方法檢測(cè)，當(dāng)發(fā)病率超過(guò)一定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)就不能再作為種薯使用。

4.2.5不同級(jí)別脫毒苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)不同級(jí)別脫毒苗對(duì)病毒感染率的不同要求，初步制定以下判斷標(biāo)準(zhǔn)，病毒感染率超過(guò)一定標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)降級(jí)使用。

甘薯脫毒苗病毒檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)（試行）

5脫毒甘薯繁育供種體系

脫毒甘薯的繁育體系是指經(jīng)?。ㄊ小^(qū)、縣）有關(guān)部門(mén)核準(zhǔn)，由不同單位組成的完成的脫毒甘薯、馬鈴薯種薯及種苗生產(chǎn)的各層次、各環(huán)節(jié)任務(wù)的組織整體。

良種利用2年后增產(chǎn)效果就不再明顯，需要每2年更換一次新脫毒薯種。因此，必須根據(jù)當(dāng)?shù)厣a(chǎn)和經(jīng)濟(jì)條件，建立起脫毒甘薯繁育與供應(yīng)體系，以源源不斷地為生產(chǎn)提供優(yōu)良脫毒薯種，確保脫毒甘薯增產(chǎn)潛力的最大發(fā)揮。各級(jí)繁育供應(yīng)體系的設(shè)置及職責(zé)如下圖所示。

脫毒甘薯繁育、供應(yīng)體系示意圖